本发明涉及临床凝血检验制剂的制备方法，具体凝血因子IX质控品制备方法，用抗人凝血因子IX单克隆抗体免疫亲和层析柱将多人份混合血浆进行亲和层析，去除多人份混合血浆中的凝血因子IX即为缺乏凝血因子IX血浆；再将多人份混合血浆与缺乏凝血因子IX血浆按照一定比例混合，制备成凝血因子IX含量为不同浓度水平的凝血因子IX质控品，加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥，获得凝血因子IX质控品。本发明制备的凝血因子IX质控品，其产品均一性、稳定性及冻干品复融后稳定性好，可代替进口产品用于凝血因子IX检测的质量控制，有利于降低检测成本，提升我国对凝血因子IX检测的能力。
1.凝血因子IX质控品制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将人静脉采集的血液与抗凝剂以体积比为9∶1加入混合，在2℃～8℃条件下离心，分离吸取上层血浆，将多人份分离后的上层血浆混合，即得多人份混合血浆；(2)免疫亲和层析柱预先用缓冲液在10℃～18℃条件下平衡；(3)多人份混合血浆加入MgCl₂后，多人份混合血浆中MgCl₂浓度为
4.5～5.5mmol/L，上免疫亲和层析柱，收集免疫亲和层析柱下方流出的血浆，即为缺乏凝血因子IX血浆；(4)将缺乏凝血因子IX血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，即制备成不同浓度水平的凝血因子IX质控品；(5)将制备的凝血因子IX质控品加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的凝血因子IX质控品制备方法，其特征在于：所述的抗凝剂为枸橼酸三钠溶液，浓度为0.109mol/L～0.129mol/L。
3.根据权利要求1所述的凝血因子IX质控品制备方法，其特征在于：所述的缓冲液包括0.02mol/LTris、0.15mol/LNaCl、8mmol/LMgCl₂，pH7.25。
4.根据权利要求1所述的凝血因子IX质控品制备方法，其特征在于：所述的冻干保护剂包括质量比例占凝血因子IX质控品的0.5～1.5％Hepes、1～5％甘氨酸、0.5～5％甘露醇。技术领域
本发明涉及临床凝血检验制剂的制备方法，具体凝血因子IX质控品制备方法。
背景技术
凝血因子IX测定具有重要的临床意义。随着凝血因子IX活性检验项目不断拓展到疾病诊断和治疗中的各个领域，使用凝血因子IX质控品对凝血因子IX活性检测进行室内质控和室间质评就显得尤其重要。目前针对凝血因子IX检测的试剂、仪器较多，不同的试剂和检测仪器、检测原理各不相同，导致其结果差别很大。无论采用何种方法，进行室内质控和参加室间质评是保障检测结果具有良好重复性和可比性的必要手段，而这些质量保证措施的开展都离不开凝血因子IX质控品。目前临床实验室使用的凝血质控物通常为多参数凝血质控品，其异常值凝血质控品除凝血因子IX水平异常外其它参数也为异常，难以保证病理性样本凝血因子IX测定结果的准确性，同时也难以保证凝血因子IX室内质控和室间质评的有效性。国内凝血质控品几乎被国外试剂厂商垄断，产品价格昂贵且水平单一，无法满足临床检验多活性水平的需求，因此，研发生产国内自主品牌的多个浓度水平的凝血因子IX质控品迫在眉睫。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种制备凝血因子IX质控品的方法及获得凝血因子IX质控品。本发明方法制备的凝血因子IX质控品为凝血因子IX多个浓度水平，且其它凝血因子含量在正常范围；该产品均一性和稳定性较好，满足临床对凝血因子IX质控品检验的质量控制要求。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：凝血因子IX质控品制备方法，包括以下步骤：(1)将人静脉采集的血液与抗凝剂以体积比为9∶1加入混合，在2℃～8℃条件下离心15分钟，相对离心力为2500g，分离吸取上层血浆，将多人份血浆混合，即得多人份混合血浆；抗凝剂为枸橼酸三钠溶液，其浓度为0.109mol/L～0.129mol/L。(2)免疫亲和层析柱预先用缓冲液在10℃～18℃条件下平衡，缓冲液包括0.02mol/LTris、0.15mol/LNaCl、8mmol/LMgCl₂，pH7.25。(3)多人份混合血浆加入MgCl₂后，多人份混合血浆中MgCl₂浓度为4.5～5.5mmol/L。上免疫亲和层析柱，收集免疫亲和层析柱下方流出的血浆，即为缺乏凝血因子IX血浆。(4)将缺乏凝血因子IX血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，即可制备成不同浓度水平的凝血因子IX质控品。(5)将制备的凝血因子IX质控品加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥。加入的冻干保护剂，包括质量比例占凝血因子IX质控品的0.5～1.5％Hepes、1～5％甘氨酸、0.5～5％甘露醇。本发明提供的凝血因子IX质控品制备方法，用抗人凝血因子IX单克隆抗体免疫亲和层析柱将多人份混合血浆进行亲和层析，去除多人份混合血浆中的凝血因子IX即为缺乏凝血因子IX血浆；再将多人份混合血浆与缺乏凝血因子IX血浆按照一定比例混合，制备成凝血因子IX含量为不同浓度水平的凝血因子IX质控品，加入冻干保护剂，分装，冷冻干燥，获得凝血因子IX质控品。本发明提供的制备方法中，抗人凝血因子IX单克隆抗体免疫亲和层析柱的制备方法为将一种能够高度特异性的连接凝血因子IX的单克隆抗体偶联至经CNBr活化的Sepharose4B琼脂糖凝胶上，组成免疫亲和层析柱。在Mg²⁺存在的条件下，当血浆通过该免疫亲和层析柱时，唯独凝血因子IX被吸附，其他凝血因子的活性基本未变。本发明制备的凝血因子IX质控品，其产品均一性、稳定性及冻干品复融后稳定性好，可代替进口产品用于凝血因子IX检测的质量控制，有利于降低检测成本，提升我国对凝血因子IX检测的能力。
具体实施方式
结合实施例，进一步阐述本发明：实施例以制备活性为30％的凝血因子IX质控品为例。(1)将人静脉采集的血液与抗凝剂以体积比为9∶1加入混合，在2℃～8℃条件下离心15分钟，相对离心力为2500g，分离吸取上层血浆，将多人份血浆混合，即得多人份混合血浆；抗凝剂为枸橼酸三钠溶液，其浓度为0.109mol/L～0.129mol/L。(2)免疫亲和层析柱预先用缓冲液在10℃～18℃条件下平衡，缓冲液包括0.02mol/LTris、0.15mol/LNaCl、8mmol/LMgCl₂，pH7.25。(3)多人份混合血浆加入MgCl₂后，多人份混合血浆中MgCl₂浓度为4.5～5.5mmol/L。上免疫亲和层析柱，收集免疫亲和层析柱下方流出的血浆，即为缺乏凝血因子IX血浆。(4)将缺乏凝血因子IX血浆与多人份混合血浆按照要求比例混合，制备凝血因子IX活性为30％左右浓度水平的凝血因子IX质控品。(5)将制备的凝血因子IX质控品加入冻干保护剂。保护剂包括1％Hepes、2％甘氨酸、2％甘露醇。进行分装，冷冻干燥。产品性能检验测试：(1)产品活性检测用SysmexCA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子IX检测试剂对实施例凝血因子IX质控品活性进行检测。表1凝血因子IX质控品的凝血因子活性测定表 检测项目 II V VII X VIII IX XI XII 因子活性(％) 99.8 92.6 98.3 96.5 93.4 1.2 100.5 93.2 由上表可知，本制备方法所得产品特异性好，能够特异性的去除凝血因子IX而对其它凝血因子含量基本无影响。(2)产品均一性测定在实施例制备的凝血因子IX质控品中分别随机抽取10支，进行准确的复溶重建。用SysmexCA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子IX检测试剂对实施例凝血因子IX质控品活性进行检测，结果依次如下：百分活性(％)29.9、30.2、30.0、29.8、29.0、29.5、30.3、30.1、30.2、29.7，平均值29.9。取实施例制备的凝血因子IX质控品3瓶，进行准确的复溶重建，混合后连续检测FIX活性10次，结果如下：百分活性(％)29.4、30.5、29.9、29.8、30.0、30.5、30.6、30.1、30.3、29.9；平均值30.1。经计算得，实施例凝血因子IX质控品瓶间重复性CV值CV瓶间为0.39％，说明该水平凝血因子IX质控品达到临床试验对于质控品均一性的通用要求(批内瓶间CV≤5.0％)。(3)产品冻干品稳定性检测将实施例制备的凝血因子IX质控品和SIEMENSP质控品置于37℃保存，分别于1天、3天、5天、7天取样，同时进行准确的复溶重建。用SysmexCA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子IX检测试剂对实施例凝血因子IX质控品活性进行检测，结果如下：表2冻干品37℃稳定性 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例凝血因子IX质控品37℃放置7天，放置前后活性波动范围＜5％，与市售进口SIEMENS异常质控血浆相当，可以认为本发明制备的凝血因子VIII质控品37℃放置7天是稳定的。(4)产品复溶稳定性检测将实施例制备的凝血因子IX质控品和SIEMENSP质控品进行准确的复溶重建，分成两份分别置于2℃-8℃和室温(20℃-25℃)保存，每隔一定时间取样进行凝血因子IX活性检测。用SysmexCA-1500全自动血凝仪及配套凝血因子IX检测试剂对实施例凝血因子IX质控品活性进行检测，结果如下：表3复溶稳定性 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例凝血因子IX质控品复溶后置于2℃～8℃和室温条件下，24小时与0小时FIX：C无明显变化，且活性波动范围均＜5％，与市售进口SIEMENS异常质控血浆相当。可以认为本产品复溶后2℃～8℃和室温存放24小时内可保持稳定。由此可见，本发明制备的凝血因子IX具有较好的开瓶稳定性。以上所述仅是以一个浓度水平为例，是本发明的优选实施方式，本发明保护的是整个技术过程和产品，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。